上一篇文章，我们详述了药企洁净环境系统的确认。本文我们将对“药企洁净区环境监测及如何进行后续环境监测数据管理”内容进行分享。
洁净区环境监测作为污染控制策略（CCS）的重要组成部分，用于监测旨在将粒子和微生物污染风险降至最低的控制措施。本篇内容将从环境监测计划及悬浮粒子、微生物监测项目操作步骤这两方面进行介绍。
2.1 环境监测生命周期
评估和定义粒子、微生物监测所需的合适取样点、取样类型、取样量和取样频率，这些要素用于执行洁净环境系统性能确认（EMPQ)。根据EMPQ结果，调整和定义部分要素进行日常风险评估后，输出风险评估报告，依据报告内容生效SOP作为日常环境监测取样计划（SOP应有点位频率汇总表和布点图内容），且SOP应包含数据管理内容，需要把日常数据统计利用起来。按取样计划执行获得数据来评价环境中的粒子和微生物分布情况，开具环境监测COA并告知使用部门。持续收集、分析、回顾数据，不断支持警戒限、行动限、环测要素、菌种库的建立及更新。变更及定期回顾推动的监测策略评估将持续确保控制措施有效。洁净区退役时，可在变更控制流程下进行回顾分析得到最终的环境监测评估，以证明该环境始终处于受控状态。
2.2 环境日常监测风险评估
风险评估报告框架可以设置以下章节：概述、目的、范围、责任人、定义和缩写、参考资料、工艺描述、风险识别、风险评估、风险控制、评估结果、回顾周期、附件及变更历史。评估应包括以下基本内容：监测状态、监测项目与方法、监测点位、监测频率、培养条件。下面分别对评估包含的基本内容，进行分项详述。
【1】监测状态
洁净室、洁净空气设备和人员的常规监测都应该在“动态”下进行，但需考虑到HVAC系统停机后洁净区恢复确认时需进行静态测试。建议洁净区应进行定期“静态”监测，通过获得的数据分析再降低频次。
【2】 监测项目与方法
温湿度和压差监测已逐步实行EMS化，其他物理参数则在洁净环境系统进行确认，在此主要聚焦粒子和微生物监测。
✫中国GMP(2010年修订)各洁净级别粒子监测标准如下表所示：
D级动态粒子标准未预先确定，但企业应根据风险评估或常规数据分析后确定。
对于粒子监测的单次取样量，有以下示例讲解：
粒子单次取样量计算公式说明：
式中V S代表取样点单次取样最低量，用L表示；
Cn,m代表相关等级规定的最大被考虑粒径的等级限值；
20代表当粒子浓度处于该等级限值时，可被检测到的粒子数。
示例：
采用中国GMP (2010年修订) 洁净区B级粒子静态监测标准，该级别静态下考虑到的粒径为5.0μm，标准为29/立方米，计算V S为(20/29)x1000≈689.7L。故洁净区B级静态下粒子单次取样量应不低于689.7L。但日常监测时考虑到采样设备的流量速率和内控标准的严格，会直接测试到700L或1000L。
因此，建议日常粒子监测单次取样量A级，动静态均为1000L；
B级静态1000L、动态100L；
C、D级动态静态均为100L。
对于粒子监测的采样次数，房间总采样次数应不低于5次，单点采样次数可以多于1次。
下表提供以下法规及机构的粒子监测标准，以供参考：
✫中国GMP(2010年修订)各洁净级别微生物动态监测标准如下：
企业应根据风险评估或常规数据分析后确定微生物静态监测标准，初期考虑设定和动态标准一致，或设定为动态标准的一半。
微生物监测分为空气微生物和表面微生物监测。空气微生物监测中，沉降菌取样是一种被动取样方法，浮游菌取样是一种主动取样方法。表面微生物监测是对环境、设备和人员的表面进行取样，较多使用的是接触碟法。
对于浮游菌单次取样量，建议A、B级单次动静态取样量均为1000L；C级单次动静态取样量均为500L；D级单次动静态取样量均为100L。考虑到动静态取样量的统一对于日常操作的便利性、动态取样量增加能采样到操作区更多代表性的空气以获得支持性数据及行业发展趋势，这边对B级、C级的动静态浮游菌测试给出了相同的取样量。具体可以参考：GB/T16293-2022（征求意见稿阶段, 尚未施行）采样量，如下表所示：
这里，也放置国内外主要法规及机构的微生物监测标准，以供参考：
✫有关具体监测方法详见本文“3.悬浮粒子、微生物监测项目操作步骤”。
【3】监测点位
静态环境监测点位可按照ISO 14644-1的数量规则进行均匀布点，亦可根据风险评估及气流流型数据增减点位。动态环境监测点位则需要通过风险评估输出，风险评估又基于工艺流、人物流的关键复杂性、暴露情况、所涉及的操作与距离、常规监测数据（若有）、确认期间获得的数据以及环境中分离的典型微生物菌群知识。在执行评估之前需定义几个要素：范围、风险因素、风险管理工具及风险因素评级标准。评估流程一般为定义关键、非关键区，识别范围内风险因素，评估风险因素等级，根据风险等级策略布点定频率，执行监测进行风险控制，得到数据获得风险降低及接受。
【4】监测频率
基于点位评估中风险因素等级定义监测频率，因地制宜。推荐A级采用每班次连续监测粒子微生物，操作结束进行表面监测；B级考虑和A级类似的方式，适当调整采样量和频率；C级每半月、D级每月粒子、微生物全测。无论采取何种频率都必须满足药典法规的基本要求，下图提供不同法规及机构的监测频率供参考：
【5】培养条件
建议TSA培养基进行双温培养，先30-35℃培养3天，之后再20～25℃培养2天。当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加SDA培养基进行监测，在20～25℃培养5～7天。下图提供国内外主要法规及机构的培养时间供参考：
2.3 环境监测数据管理
（1）日常数据应按统一记录格式集中起来，原始记录应考虑采用DMS (数据库管理系统)管理，可采用速度及准确性可靠的图像扫描系统用于数据汇总、计算机化系统对数据进行跟踪处理。
（2）应根据法规指南和历史数据制定书面形式的警戒限和行动限，最大行动限可以为合格限。
（3）适当的频率回顾和分析环境监测数据趋势，将有助于证明工艺稳定性和评估整体环境控制效果，包括回顾风险评估、环境监测方案、警戒行动限和纠偏措施的适用性，并持续更新。
（4）对环境和人员监测中的分离菌进行微生物鉴定获得的数据构成的本地菌种库也属于数据管理的一部分，有助于评估清洁或消毒规程、方法、清洁剂或消毒剂及微生物监测方法的有效性，尤其当超过监测限度时，微生物鉴定信息有助于污染源的调查。
测试前确认洁净房间温湿度压差在标准范围内（以下“3.2微生物”章节同），计数器配备等动力采样头、已经过自净并且合格。依据环境监测计划中的点位频率汇总表设定计数器参数，一般将计数器按布点图放置在离地0.8m～1.5m的工作高度取样或直接放置在操作台面。对于单向流，计数器采样管口应正对气流方向; 对于非单向流，采样管口应向上。采样时，测试人员应在采样口的下风侧，并较少活动。测试时先测高级别区域，再测低级别区域；如果测完低级别区域再测高级别区域建议再次自净以排除低级别测试时粒子残留在设备内对高级别粒子测试时计数的可能影响。采样结束的结果判定，建议为每个取样点的单次取样量粒子浓度不可超过相应级别规定的浓度限值。
3.2 微生物
3.2.1 通用操作
推荐使用商业化预制培养基，脱去培养基外包装，进入洁净区使用。监测前检查培养皿无污染。每监测批或每监测级别同步取2块平皿作过程阴性对照。待全部采样结束后，包装移至培养室，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。培养结束后肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
3.2.2 沉降菌
依据环境监测点位频率汇总表和布点图进行监测，在平皿上做好相应标识，一般在离地0.8m～1.5m的工作高度取样或直接放置在操作台面，从里到外摆放逐个慢慢打开培养皿盖后平移至边缘斜靠，让培养基采集表面暴露在空间中，测试时培养皿暴露时间应不大于4h（或经验证的暴露时间）。结果判定，过程阴性对照应为阴性，每个测试点的沉降菌数不可超过相应级别规定的限值。同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累计计数，累计结果不可超过相应级别规定的限值。如果监测时间少于4小时，则以4小时沉降标准判定，无需另外折算。
3.2.3 浮游菌
测试前需要对采样器进行消毒，必要时需要对采样管及采样头进行灭菌处理。采样前采样器、采样头应干燥，依据环境监测点位频率汇总表设定采样器参数，之后依据布点图，将浮游菌采样器放置一般在离地0.8m～1.5m的工作高度取样，或直接放置在操作台面，并离开送风面至少30cm，放入培养皿，盖紧采样头，进行采样监测，监测结束后在平皿上做好相应标识。测试时先测高级别区域，再测低级别区域。采样时采样头方向及人员位置规定同悬浮粒子测试法。在得到培养皿计数后，依据设备附带的统计修约表对计数进行修约，在利用得到的修约校正值进行结果计算。结果判定，过程阴性对照应为阴性，每个测试点的浮游菌浓度不可超过相应级别规定的限值。
3.2.4 表面微生物
对于规则表面或平面，建议使用预制培养基接触碟。关键操作结束后打开碟盖，使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样点表面充分接触无气泡，再盖上碟盖。接触时间为5~10秒，不能转动或移动。
取样后在平皿上做好相应标识，采用三步法（第一步：干擦拭去除可见琼脂；第二步：喷消毒剂湿擦；第三步：干擦去除残留消毒剂。），以除去残留琼脂。结果判定，过程阴性对照应为阴性，每个测试点的接触碟菌落数不可超过相应级别规定的限值。
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参考资料
1. 药品生产质量管理规范（2010年修订）附录1：无菌药品.
2. 欧盟人用和兽用药品生产质量管理规范附录1：无菌药品生产.
3. 药品GMP指南第2版：无菌制剂.
4. ISO14644-1《洁净室及相关受控环境》-part1：空气洁净度分级.
5. USP<1116>无菌工艺环境的微生物控制和监测.
6. GB/T16292-2010医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法、GB/T16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法、GB/T16294-2010医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法.
7. 《中国药典》2020版 9205药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则.
8. PDA TR13 Fundamentals of an Environmental Monitoring Program.
9. FDA无菌药品生产现行生产质量管理规范行业指南.
10. PIC/S药品良好生产规范指南附件1：无菌药品的生产.